电针及药物抗抑郁的行为学及表观遗传学机制研究

【摘要】抑郁症是常见的危害人类身心健康的一类精神疾病。近年来抑郁症发病率呈逐年上升的趋势。据世界卫生组织预测,到2020年,抑郁症可能成为仅次于心脏病的严重威胁人类健康、增加社会经济负担的第二大疾病。加强抑郁症的防治,寻找积极、有效的治疗方法,具有非常重要的社会和经济意义。目前针对抑郁症的临床治疗手段主要是药物治疗。但西药在治疗抑郁症的过程中存在着疗效不全(有效率仅70%左右),毒副反应大,起效慢,复发率高等问题。针刺治疗抑郁症在中国具有悠久的历史,并且具有安全、有效、简便、几乎无毒副作用的优点。因此探讨抑郁症发病机制,深入研究电针及药物对抑郁症的治疗效果和作用机制具有重要的意义和价值。大多数学者认为抑郁症可能是心理社会应激、遗传及各种生物学改变等多种因素交互作用的结果。但其具体发病机制尚不明确。重大应激性生活事件是导致抑郁症的重要原因之一；生物学改变方面普遍认同的是抑郁症的单胺类神经递质假说,该假说认为抑郁症与脑内的去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)等单胺类神经递质及其相关受体的异常有关。临床应用最广泛的抗抑郁药,也大部分是调节单胺类神经递质的含量及受体改变的。上述抗抑郁药物能快速引起脑内单胺类神经递质的变化,但与用药数周后才产生临床疗效之间的矛盾,使得抑郁症的病因学研究已经不仅仅局限于中枢单胺类神经递质系统功能的失调。本实验室的研究已经发现慢性应激抑郁模型大鼠海马齿状回神经干细胞的增殖显著减少；而给予传统三环类抗抑郁药氯丙咪嗪或应用针刺治疗后,海马内神经干细胞的增殖情况显著改善,甚至对神经胶质细胞的增殖也有显著的改善。而新近的一些研究已经提出重性抑郁障碍可能是遗传和表观遗传共同作用的结果。因此,现今对抑郁症的研究已涵盖神经内分泌、神经免疫、神经发育和表观遗传等多个方面,并且都汇聚到与神经元相关的分子以及相关信号转导的研究方向。表观遗传学(epigenetics)是基于对表观遗传修饰(epigeneticmodification)的认识而开辟了一个新领域,是研究转录前基因在染色质水平的结构修饰对基因功能的影响,这种修饰可通过细胞分裂和增殖周期进行传递。早期的研究发现给精神病人应用L-蛋氨酸,能恶化一部分精神分裂症病人的精神症状,而L-蛋氨酸可以为基因的甲基化提供甲基。近来,较多的实验研究也显示,在抑郁症中某些基因将会出现表达过度升高或降低,可是在抑郁症基因组研究中,尚未发现确切的基因变异。这些提示在基因本身之外,可能还有其他的因素如表观修饰,会引起基因表达的异常。基于以上研究回顾,提示抑郁症的发病机制可能与表观遗传有千丝万缕的联系,尤其是外界应激因素诱发抑郁症状与表观修饰作用于基因表达,有着相通之处。那么针对抑郁症治疗的各种方法如电针,以及各种抗抑郁药物,它们治疗抑郁症的机制是否和表观修饰相关呢?在电针或抗抑郁药物治疗中有哪些基因发生了表观修饰后的表达改变呢?本研究正是从表观遗传的角度出发,探讨电针及抗抑郁药物的作用机制,观察电针和抗抑郁药物是否通过表观修饰的方式参与到抑郁症的治疗过程中。在表观遗传学研究中,DNA甲基转移酶(DNAmethytransferase,Dnmt)是非常重要的一种表观修饰酶。Dnmt3L蛋白是一种与Dnmt3类似的蛋白,虽然没有单独的催化活性,但是Dnmt3L蛋白可与Dnmt3a和Dnmt3b结合,提高他们的催化活性,正向调节DNA从头甲基化(denovomethylation),因而它是DNA从头甲基化的调节因子。在本研究中Dnmt3L基因是关注的基因之一。检测抑郁动物以及药物治疗后动物海马脑区中Dnmt3L基因的表达及Dnmt3L蛋白的含量变化是本研究的目的之一。髓鞘碱性蛋白(myelinbasicprotein,MBP),是神经系统髓鞘的主要构成蛋白之一。MBP蛋白含量的变化往往作为评判脑损伤的信号之一。近来的一些研究发现,癫痫发作后中枢神经系统的髓鞘变化与血清和脑脊液中MBP蛋白的变化都是相关的。早在1986年,就有研究发现精神分裂患者血清中MBP蛋白含量明显升高。而抑郁症患者脑内也发生器质性改变,抑郁症患者脑内MBP蛋白含量是否有变化尚未见报道。因此,从表观遗传学角度观察抑郁大鼠海马内MBP基因的表达变化也是本研究的重要目的之一。总之,本研究通过电针“百会”“阳陵泉”以及腹腔注射依他普仑或氯丙咪嗪这些干预手段,在抑郁症的亚急性和慢性动物模型上用行为学方法评价其抗抑郁效果；然后从表观修饰的角度,尤其是在甲基化修饰方面观察电针及药物是否引起Dnmt3L和MBP基因的修饰改变,从而对抑郁症的发病机制以及电针和药物治疗机制进行探讨。本研究分为两个部分。第一部分：电针及药物对获得性无助(LearnedHelplessness)大鼠的抗抑郁作用和表观遗传学机制研究。(1)复制LearnedHelplessness大鼠抑郁模型,并确定检测参数。(2)使用辐射热测痛仪测定热刺激反应阈值,应用vonFrey细丝测定机械刺激反应阈值,并通过实验性痛刺激反应阈值的测定评价LearnedHelpless大鼠抑郁模型。(3)应用穿梭箱实验、强迫游泳实验、敝箱实验和高架十字迷宫实验,从行为学角度,观测电针、依他普仑和氯丙咪嗪的抗抑郁效果。(4)应用全基因组CpG岛甲基化芯片,利用差异甲基化杂交技术对正常大鼠海马及Helpless大鼠海马进行基因组CpG岛区域甲基化分析,筛选可能与抑郁症发生有关的甲基化差异基因：Dnmt3L和MBP。(5)应用逆转录PCR和Real-TimePCR技术检测正常大鼠、Helpless大鼠、依他普仑与氯丙咪嗪治疗组大鼠海马中Dnmt3L和MBP的mRNA水平。(6)应用Westernblot检测helpless大鼠及各治疗组的大鼠海马Dnmt3L和MBP蛋白水平变化。第二部分：电针对慢性不可预知刺激(chronicunpredictablestress,CUS)抑郁大鼠模型的抗抑郁作用及表观遗传学机制初探。(1)复制CUS大鼠抑郁模型。(2)应用强迫游泳实验、敞箱实验和高架十字迷宫实验,从行为学角度,观测电针的抗抑郁效果。(3)Real-TimePCR技术检测电针治疗后各组大鼠海马中Dnmt3L和MBP的mRNA水平变化。实验结果如下：1.电针及药物对LearnedHelplessness大鼠抗抑郁作用和表观遗传学机制研究1.1LearnedHelpless大鼠抑郁模型的建立和评价20只Wistar大鼠,在经过不可逃避足底电击后的1、2、3天,对可逃避的足底电击的逃避失败次数逐渐增加,但是在不可逃避足底电击后的第4和第5天逃避失败次数趋于稳定,两者间无显著性差异,但都显著高于不可逃避足底电击后的第1、2天的逃避失败次数。表明经过不可逃避足底电击的大鼠,在电击后第3天开始表现出稳定的无助行为。观察10只Helpless抑郁大鼠,在不可逃避足底电击后的第3、4、5、6、7天连续进行穿梭回避反应测试。结果显示,不可逃避足底电击后的第3、4、5天,100%大鼠保持Helplessness行为；第6天,还有90%的大鼠保持Helplessness行为；第7天,只有70%的大鼠保持Helplessness行为。表明LearnedHelplessness模型大鼠在造模后一周,仍有70%的大鼠可保持抑郁样行为。1.2LearnedHelpless大鼠的实验性痛刺激反应阈值分别在不可逃避足底电击前和电击后第1、3、5、7天五个时间点,观察正常组,Helplessness和Non-helplessness三组大鼠的机械性刺激反应阈值和热刺激反应阈值。结果显示,Helpless大鼠左脚和右脚的机械性刺激反应阈值,从造模后的第1天到第7天均显著高于正常组。与Non-helpless大鼠相比,Helpless大鼠左脚和右脚的机械性刺激反应阈值,从造模后的第3、5、7天均显著增高。Non-helpless大鼠左脚和右脚的机械性刺激反应阈值基本与正常组无差异。在热刺激反应阈值方面,测定结果与机械性刺激反应阈值变化相同。在给予氯丙咪嗪(Clomipramine)治疗后,正常组、Non-helpless和氯丙咪嗪治疗组大鼠左脚和右脚的机械性刺激反应阈值,均显著低于Helpless组大鼠。然而氯丙咪嗪治疗组大鼠的热刺激反应阈值,与Helpless组大鼠相比无显著性改变。也即,氯丙咪嗪可改善Helpless大鼠的机械性刺激反应阈值,但对热刺激反应阈值无明显影响。1.3电针和抗抑郁药物对LearnedHelplessness大鼠抗抑郁作用的行为学观察1.3.1电针抗抑郁作用的行为学观察从基因纯合性和表型一致性的角度考虑,分别在近交系、VVistar大鼠和封闭群SD大鼠两个品系动物模型上给予电针干预治疗,大鼠均分为五组：正常组(Normal),模型组(Model),抑郁模型+假电针组(ShamEA),抑郁模型+电针组(EA),抑郁模型+氯丙咪嗪组(Clomipramine)。1.3.1.1穿梭箱实验经过电针治疗的Wistar和SD大鼠,在可逃避足底电击刺激的穿梭箱检测中,均显示出穿梭失败次数与模型组无明显差异,但是经氯丙咪嗪治疗的大鼠穿梭失败次数显著低于模型组。反映出电针对Helpless大鼠的穿梭回避反应能力改善不明显。1.3.1.2强迫游泳实验SD大鼠经过电针或氯丙咪嗪治疗后,在强迫游泳实验中挣扎时间显著高于模型组。反映出电针可改善Helpless大鼠的绝望行为。1.3.1.3敞箱实验在敞箱实验中,经过电针或氯丙咪嗪治疗的Wistar大鼠,与模型大鼠相比,在水平方向的总位移显著增高,直立次数也明显增多。反映出电针可显著改善Helpless大鼠的自发行为和探究行为。1.3.1.4高架十字迷宫实验在高架十字迷宫实验中,经过电针或氯丙咪嗪治疗的Wistar和SD大鼠,开臂滞留时间百分比均显著高于抑郁模型组。反映出电针可显著改善Helpless大鼠的焦虑行为。1.3.2依他普仑及氯丙咪嗪抗抑郁作用的行为学观察仍然从基因纯合性和表型一致性的角度考虑,分别在近交系Wistar大鼠和封闭群SD大鼠两个品系动物模型上分别给予依他普仑腹腔注射治疗,大鼠均分为五组：正常组(Normal),模型组(Model),抑郁模型+生理盐水组(Saline),抑郁模型+依他普仑组(Escitalopram),抑郁模型+氯丙咪嗪组(Clomipramine)。1.3.2.1穿梭箱实验经过依他普仑治疗的Wistar和SD大鼠,在可逃避足底电击刺激的穿梭箱检测中,穿梭失败次数均显著低于模型组,这一结果与氯丙咪嗪治疗组完全相似。这反映出依他普仑和氯丙咪嗪均可显著改善Helpless大鼠的穿梭回避反应能力。1.3.2.2强迫游泳实验SD大鼠经过依他普仑或氯丙咪嗪治疗后,在强迫游泳实验中挣扎时间显著高于模型组。这反映出依他普仑和氯丙咪嗪均可显著改善Helpless大鼠的绝望行为。1.3.2.3敞箱实验在敞箱实验中,与模型组大鼠相比,经过依他普仑或氯丙咪嗪治疗的Wistar和SD大鼠,在水平方向的总位移都显著升高,在垂直方向的直立次数也显著增多。这反映出依他普仑和氯丙咪嗪均可显著改善Helpless大鼠的自发行为和探究行为。1.3.2.4高架十字迷宫实验在高架十字迷宫实验中,经过依他普仑或氯丙咪嗪治疗的WistarSD大鼠,开臂滞留时间百分比均显著高于抑郁模型组大鼠。这反映出依他普仑和氯丙咪嗪均可显著改善Helpless大鼠的焦虑行为。1.4通过全基因组CpG岛甲基化芯片筛查差异甲基化基因利用差异甲基化杂交技术对正常大鼠海马及Helpless大鼠海马进行基因组CpG岛区域甲基化分析,筛选与抑郁症发生有关的甲基化差异基因,在通过基因功能分类和功能分析,依log-Ratio值大于0.5为差异显著性标准选出Dnmt3L和MBP两个与抑郁症发病有可能相关的基因。对这两个基因的启动子区域亚硫酸盐修饰后的甲基化特异性聚合酶链反应(MethylationSpecificPolymerasechainreaction,MSP)产物序列的测序工作还在进行当中,在此未能给出详细的基因甲基化位点和甲基化程度。1.5逆转录PCR和Real-TimePCR检测结果应用逆转录PCR和Real-TimePCR技术检测正常大鼠、Helpless大鼠、生理盐水组、依他普仑、氯丙咪嗪治疗组大鼠海马中Dnmt3L基因和MBP基因的mRNA变化。Helpless大鼠海马MBP基因的mRNA水平显著高于正常组,而依他普仑和氯丙咪嗪治疗后大鼠海马MBP基因的nRNA水平显著低于模型组,同时也低于正常组。Helpless大鼠和生理盐水组大鼠的海马Dnmt3L基因的mRNA水平显著低于正常组,而依他普仑和氯丙咪嗪治疗后大鼠海马的Dnmt3L基因的mRNA水平显著高于模型组。1.6WesternBlot检测结果应用WesternBlot方法检测正常大鼠、Helpless大鼠、生理盐水组、依他普仑、氯丙咪嗪治疗组大鼠海马中Dnmt3L和MBP的蛋白变化。Helpless大鼠和生理盐水组大鼠海马中MBP蛋白含量显著高于正常组、依他普仑和氯丙咪嗪治疗组大鼠。Helpless大鼠和生理盐水组大鼠的海马Dnmt3L蛋白含量显著低于正常组、依他普仑和氯丙咪嗪治疗组大鼠,依他普仑治疗组大鼠海马中Dnmt3L蛋白含量显著高于正常组。1.7小结上述实验结果显示,实验大鼠经不可逃避足底电击后第3天开始表现出稳定的Helpless行为,而且有70%的模型大鼠可以保持这种行为一周时间。①Helpless大鼠的机械性刺激反应阈值和热刺激反应阈值较正常组或Non-helpless组均有所增高,给予氯丙咪嗪后可降低Helpless大鼠的机械性刺激反应阈值,但对于热刺激反应阈值无明显影响。②在LearnedHelplessness大鼠抑郁模型上,给予电针治疗可以改善抑郁大鼠的探究行为、绝望行为、焦虑行为和自发行为,但是对可逃避足底电击的回避行为没有改善。③给予依他普仑药物治疗后,能够对穿梭回避反应、探究行为、绝望行为、焦虑行为和自发行为均有所改善,并和氯丙咪嗪治疗效果相当。④芯片检测结果表明,Helpless大鼠与正常大鼠相比较而言,他们的大脑海马中存在基因的CpG岛区域甲基化差异。根据差异程度及基因功能,在这些基因中筛选出Dnmt3L和MBP两个与抑郁症发病有可能相关的基因。⑤通过检测发现Helpless大鼠海马的Dnmt3L基因mRNA水平显著降低,在应用依他普仑或氯丙咪嗪后可以逆转。同样也发现Helpless大鼠海马的MBP基因mRNA水平显著升高,给予依他普仑或氯丙咪嗪后也可以逆转。⑥通过蛋白检测,发现Helpless大鼠和生理盐水组大鼠海马MBP蛋白含量显著升高,Dnmt3L蛋白含量显著降低。此外,依他普仑治疗组大鼠海马的Dnmt3L蛋白含量显著高于正常组。2.电针对CUS模型大鼠的抗抑郁作用及表观遗传学机制初探2.1CUS大鼠抑郁模型的复制主要采用6种应激方法随机在9周内应用,制备慢性不可预知性应激刺激大鼠抑郁模型,在该慢性动物模型上给予电针干预治疗。大鼠均分为五组：正常组(Normal),抑郁模型组(Model),抑郁模型+假电针组(ShamEA),抑郁模型+电针组(EA),抑郁模型+氯丙咪嗪组(Clomipramine)。2.2电针对CUS大鼠抗抑郁作用的行为学观察2.2.1强迫游泳实验SD抑郁大鼠经过电针治疗后,在强迫游泳实验中挣扎时间显著高于模型组,经氯丙咪嗪治疗的大鼠也表现出同样的结果,但是电针治疗组与氯丙咪嗪治疗组之间无显著性差异。这反映出电针可明显改善CUS大鼠的绝望行为。2.2.2敞箱实验在敝箱实验中,经过电针和氯丙咪嗪治疗的抑郁大鼠,在水平方向的总位移都显著高于模型组大鼠,而且电针组的水平总位移也显著高于氯丙咪嗪组。在垂直运动方面,经过电针和氯丙咪嗪治疗后的大鼠直立次数均显著多于模型组。这反映出电针可明显改善CUS大鼠的自发行为和探究行为。2.2.3高架十字迷宫实验在高架十字迷宫实验中,经过电针和氯丙咪嗪治疗的SD抑郁大鼠,开臂滞留时间百分比均显著高于模型组。这反映出电针可明显改善CUS大鼠的焦虑行为。2.3电针治疗后大鼠海马中Dnmt3L基因和MBP基因的mRNA变化通过Real-TimePCR方法检测出CUS抑郁模型+假电针组大鼠海马MBP基因的mRNA水平显著高于正常组,而电针和氯丙咪嗪治疗后大鼠海马的MBP基因的mRNA水平显著低于假电针组。CUS抑郁模型+假电针组大鼠海马Dnmt3L基因的nRNA水平显著低于正常组,而电针和氯丙咪嗪治疗后大鼠海马的Dnmt3L基因的]mRNA水平显著高于假电针组。2.4小结上述实验结果显示：①在CUS大鼠抑郁模型中,给予电针治疗可以明显改善抑郁大鼠的探究行为、绝望行为、焦虑行为和自发行为。而且电针治疗组与氯丙咪嗪治疗组在挣扎时间、直立次数以及开臂滞留时间百分比等方面也无明显差异,仅在水平总位移中电针治疗组显著优于氯丙咪嗪组。②通过检测发现CUS抑郁大鼠海马Dnmt3L基因的mRNA水平显著降低,在应用电针或氯丙咪嗪治疗后则升高。③同样发现CUS抑郁大鼠海马MBP基因的mRNA水平显著升高,给予电针或氯丙咪嗪治疗后则降低。综上所述,本研究可获得以下结论：1.Helpless抑郁大鼠的机械性刺激反应阈值和热刺激反应阈值会升高,而氯丙咪嗪可逆转机械性刺激反应阈值的升高,却不能逆转热刺激反应阈值的升高。2.在LearnedHelplessness大鼠抑郁模型上,电针、依他普仑和氯丙咪嗪均有抗抑郁作用。依他普仑能够对穿梭回避反应、探究行为、绝望行为、焦虑行为和自发行为均有所改善,氯丙咪嗪治疗效果与之相当。电针仅在穿梭回避反应方面没有明显效果。3.LenrnedHelplessness大鼠抑郁发生过程及药物治疗中可能与Dnmt3L基因和MBP基因表观调节相关。4.在CUS抑郁大鼠抑郁模型上,电针和氯丙咪嗪均可以改善CUS抑郁动物模型的抑郁行为。5.CUS抑郁大鼠抑郁发生过程及电针治疗中可能有Dnmt3L基因和MBP基因表观调节变化。
【作者】李炳；
【导师】吴根诚；
【作者基本信息】复旦大学，中西医结合基础，2011，博士
【关键词】抑郁症；机械性刺激反应阈值；热刺激反应阈值；电针；氯丙咪嗪；依他普仑；表观遗传学；甲基化修饰；DNA甲基转移酶3L；髓鞘碱性蛋白；

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